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Date d'inscription : 21/09/2006

MessageSujet: H   Ven 19 Oct - 4:29

HEKTOEN Gélose


La gélose Hektoen est un milieu de choix pour l’isolement des Entérobactéries pathogènes : la présence d’extrait de levure et de sucres, la qualité des peptones favorisent la croissance des salmonelles et des shigelles même fragiles; des sels biliaires assurent le pouvoir sélectif en limitant le développement des coliformes et de Proteus.

La gélose Hektoen a été formulée en 1967 par KING et METZGER à l’institut Hektoen afin d’augmenter la fréquence d’isolement des Shigella et des Salmonella comparativement à celle obtenue avec d’autres milieux d’isolement sélectif.

Ce milieu qui permettait d’isoler un large éventail d’entérobactéries pathogènes était en contrepartie moins inhibiteur vis à vis des germes entériques non pathogènes. La formulation actuelle diffère de l’originale par l’élimination du désoxycholate et par la concentration en sels biliaires qui a été réduite.
Parallèlement, la concentration en peptones a été augmentée afin de contrebalancer l’effet inhibiteur des sels biliaires.

L’orientation de l’identification des bactéries isolées est fondée sur l’attaque de trois sucres, lactose, salicine et saccharose, permettant un repérage plus précis des salmonelles et des shigelles qui n’attaquent aucun de ces sucres. La forte concentration en lactose favorise la visualisation des entérobactéries en évitant le problème des fermentations tardives. Les autres glucides ont été introduits afin d’assurer une différenciation plus performante et de réduire la toxicité engendrée par les indicateurs colorés, de manière à obtenir une excellente récupération des Shigella.

Deux indicateurs permettent de visualiser la réaction : le bleu de bromothymol qui vire au jaune à l’acidité et la fuchsine qui se colore en présence d’aldéhyde (d’où une teinte saumonée si la souche utilise l’un ou plusieurs des sucres présents).
Une différenciation supplémentaire reposant sur la production d’H2S est également possible grâce à la présence de thiosulfate et de citrate de fer : elle se traduit par des colonies à centre noir, coloration due à la formation de sulfure de fer.

L’addition de 10 à 20µl/ml de novobiocine au milieu améliore ultérieurement la sélectivité, c’est à dire l’inhibition de la croissance des Citrobacter et des Proteus dont les colonies ressemblent à celles des Salmonella (centre noir).




FORMULE (en g/l d'eau distillée)

Protéose peptone: 12.000
Extrait de levure: 3.000
Chlorure de sodium: 5.000
Thiosulfate de sodium: 5.000
Sels biliaires: 9.000
Citrate de fer ammoniacal: 1.500
Salicine : 2.000
Lactose : 12.000
Saccharose : 12.000
Fuschine acide : 0.100
Bleu de bromothymol : 0.065
Agar : 14.000
pH= 7.5


Chauffer légèrement et laisser bouillir quelques secondes. NE PAS AUTOCLAVER. Refroidir à 60°C et couler en boîtes de Petri.

LECTURE

Colonies saumon:
Escherichia
Citrobacter
Klebsiella
Enterobacter
Serratia
Citrobacter diversus
Y. enterolitica
Hafnia alvei (E. hafniae)


Colonies saumon à centre noir:
Proteus vulgaris

Colonies bleues à centre noir:
Proteus mirabilis
Salmonella H2S +
Edwardsiella

Colonies vertes:
Salmonella H2S +
Shigella
Providencia
H. alvei
Citrobacter amalonaticus
Plesiomonas
Aeromonas


Les Pseudomonas donnent des petites colonies bleu-brunâtre (test de l’oxydase)
Le vibrion cholérique cultive bien sur ce milieu et donne des colonies jaune rosé
Certaines souches de Salmonella choleraesuis subsp arizonae et de Shigella sonnei donnent des colonies jaune saumon.


HUGH ET LEIFSON


De l’étude du métabolisme énergétique, il découle que le glucose peut être métabolisé par voie oxydative ou fermentative; des milieux à lecture directe vont permettre de distinguer les deux processus.

Le métabolisme fermentatif, favorisé par l’anaérobiose, engendre de nombreux produits acides : on peut facilement les mettre en évidence dans de simples eaux peptonées, glucosées et additionnées d’indicateur de pH.

Le métabolisme oxydatif ne donne naissance qu’à de petites quantités de composés acides et uniquement lorsque seront présentes de bonnes conditions d’oxygénation.
Par ailleurs, le métabolisme protéique produit de nombreux composés basiques, qui risquent de masquer les composés acides précédents. Aussi pour déceler un métabolisme oxydatif doit-on :
-opérer le plus possible en aérobiose,
- utiliser des milieux :
◊ peu peptonés (pour restreindre le métabolisme azoté),
◊ peu tamponnés (pour faciliter la lecture),
◊ et gélosés (pour limiter la diffusion des composés acides).

Le milieu de Hugh et Leifson répond à ces exigences.


FORMULE (en g/l d'eau distillée)

Tryptone :2.00
Extrait de levure : 1.00
Chlorure de sodium : 5.00
Phosphate bipotassique : 0.30
Bleu de bromothymol 0.03
Agar 12 à 18
pH= 7.2


Répartir en tubes de 18 x 180 à raison de 10 ml par tube.
Stériliser 20 mn à 115°C.


UTILISATION ET LECTURE

Régénérer les milieux avant emploi (prévoir deux tubes par essai.).
Ramener à 50°C . Ajouter aseptiquement une solution stérile de glucose de façon à obtenir une concentration finale à 1%.
Mélanger et solidifier sous courant d’eau froide.

Ensemencer par piqûre centrale à l’aide d’une pipette Pasteur chargée d’une culture, de préférence liquide.
Sur les deux tubes, un sera étuvé tel quel; l’autre sera recouvert d’une couche de 1 à 1,5 cm d’épaisseur d’huile de paraffine.

Placer les tubes à l’étuve à 30°C ou 37°C en ne revissant pas les bouchons à fond.

La lecture s’effectue après 24 heures au plus (pour les bactéries oxydatives et certaines bactéries fermentatives à croissance lente)




L’étude permet de distinguer trois catégories de bactéries :

1)Les bactéries fermentatives
Acidification rapide et égale dans les deux tubes qui deviennent jaunes sur toute la hauteur de la piqûre d’inoculation.
La production de gaz se traduit par la présence de bulles dans la gélose. La mobilité se traduit par un trouble qui diffuse dans le milieu.

2)Les bactéries oxydatives
Absence de culture ou culture légère sans acidification dans le tube fermé (avec la vaseline). Dans le tube ouvert (sans vaseline), acidification modérée et assez lente, débutant en surface.

3)Les bactéries inactives ou “inertes”
Peu ou pas de culture dans le tube fermé; dans le tube ouvert : culture sans modification de pH ou une alcalinisation plus ou moins forte en surface.
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