MILIEUX DE CULTURE MICROBIO ALIMENTAIRE

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MessageSujet: G   Ven 19 Oct - 2:44

GELATINE AU CHARBON



Les disques de gélatine au charbon permettent la détection de la gélatinase chez les bactéries.

Les disques sont préparés selon la méthode de Kohn, constitués de gélatine formolée à laquelle on a ajouté du charbon finement pulvérisé. Ainsi traitée, la gélatine est stable à 37°C et son attaque se traduit par la libération de particules de charbon qu’il est facile de remettre en suspension dans le milieu.

Leur utilisation est particulièrement recommandée pour l’identification des germes liquéfiant lentement la gélatine (Arizona par exemple). La réaction peut être lue en quelques jours au lieu de plusieurs semaines avec la méthode classique de liquéfaction de la gélatine en tube. Pour les germes très gélatinolytiques, le résultat est souvent obtenu en quelques heures.


PREPARATION DES DISQUES DE KOHN

Ces disques sont commercialisés mais il est possible de préparer soi-même la gélatine au charbon que l’on découpe alors pour plus de facilité, en cubes.

1) PREPARATION
Gélatine 15 g
Eau 100 ml

Chauffer au bain-marie jusqu’à dissolution complète. Laisser refroidir à 45°C et ajouter, en mélangeant activement, 4 g de charbon de bois en poudre fine.
Couler dans des moules sur une épaisseur de 0,5 cm. On peut utiliser des couvercles de boîtes en plastique enduites de vaseline.
Laisser solidifier puis porter 1/2 heure au réfrigérareur.
Démouler et faire séjourner les plaques pendant 24 heures dans la solution de formol suivante:

Formol à 40% 1 vol
Eau 69 vol

Découper en cubes et laver à l’eau courante 24 à 48 heures pour éliminer le formol.
Introduire les cubes dans des flacons contenant de l’eau distillée. Tyndalliser en chauffant 1/2 heure à 100°C pendant 3 jours de suite


UTILISATION

1) METHODE DE KOHN
Mettre dans un tube à hémolyse, 2 ml d’eau physiologique stérile ( le bouillon nutritif est à éviter car il exerce une activité inhibitrice sur la protéolyse).

Réaliser une suspension très dense du germe. Prélever avec une pince stérile un disque de gélatine au charbon et le déposer dans la suspension microbienne très dense.

Ajouter 1 à 2 gouttes de toluène. Fermer hermétiquement (bouchon de caoutchouc). Placer à l’étuve à 37°C et observer après quelques heures, puis tous les jours, pendant 8 jours.


2) METHODE DE LAUTROP
Des résultats plus rapides peuvent être obtenus avec une solution 0,01 M de chlorure de calcium dans l’eau physiologique; l’ion calcium paraissant essentiel à la production de la gélatinase chez certains germes. Ajouter une goutte de toluène * et incuber comme ci-dessus.

* La suppression du toluène peut être envisagée dans certains cas, notamment pour les bacilles Gram-négatifs, aérobies stricts; certaines souches attaqueraient préférentiellement le toluène avant de dégrader la gélatine.

LECTURE

La liquéfaction se manifeste par l’apparition de particules de charbon qui sédimentent au fond du tube, puis le disque se désagrège complètement avec formation d’un nuage noir.


GELATINE NUTRITIVE



La gélatine nutritive est un milieu utilisé pour la production de la gélatinase par certains germes.

Les micro-organismes qui dégradent la gélatine provoquent une liquéfaction du milieu.

FORMULE (en g/l d'eau distillée)


Peptone : 10.0
Extrait de viande: 4.0
Sodium chlorure: 2.5
Gélatine 120,0

pH= 6.8-7.0


Mélanger les ingrédients en chauffant jusqu’à liquéfaction complète de la gélatine.
Répartir en tube à raison de 10 ml/tube.
Stérilisation pendant 10 minutes à 115°C.

UTILISATION ET LECTURE


Pratiquer l’ensemencement par piqûre centrale.
Mettre les tubes à incuber à la température désirée.

Dans ces conditions, certains germes liquéfient la gélatine en des temps variables et sous des formes différentes (en clou, en cupule, en doigt de gant, en entonnoir, etc…), d’autres ne la liquéfient pas, mais donnent des cultures le long du trait d’ensemencement.

Si l’incubation est pratiquée à 37°C ou plus, la gélatine est liquide et il convient de refroidir les tubes avant de les examiner.


GELOSE BLANCHE



Gélose à l’eau employée dans la technique de dénombrement en double couche et pour obturer les tubes de milieu liquide.

La gélose blanche est préconisée dans les normes :
- AFNOR V08-011 (ISO 4833) , NF V 59-101 concernant le dénombrement des microorganismes par comptage des colonies obtenues à 30°C ;
- NF V 04-506 pour le dénombrement des microorganismes dans les viandes et les produits à base de viande par la méthode de comptage des colonies obtenues à 25°C,
- NF V08-051 relative à la méthode de routine pour le dénombrement des microorganismes par comptages des colonies obtenues à 30°C ;
- NF V08-053 concernant le dénombrement des Escherichia coli beta-glucuronidase positive par comptage des colonies à 44°C ,
- NF V 08-405 qui traite de la recherche des Clostridium thermophiles dans les conserves,
- NF V 08-407 pour le dénombrement des spores thermorésistantes de Bacillus et de Clostridium thermophiles dans les conserves par la méthode du NPP,
- FIL internationale 146 :1991, concernant l’identification des microorganismes caractéristiques du yaourt..


FORMULE (en g/l d'eau distillée)


Agar : 12 à 18
(selon pouvoir gélifiant)
pH= 7.0


Dissoudre la gélose en portant à ébullition.
Répartir en tubes à raison de 4 à 5 ml par tube.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.

UTILISATION


La gélose blanche liquéfiée et ramené à 45°C au bain-marie, est coulé à la surface du premier milieu ensemencé et solidifié.

Il peut être conseillé de verser une quantité plus importante de gélose blanche (environ 8 ml) lorsqu’il est soupçonné la présence de germes envahissants tels les Proteus ou Bacillus.


GELOSE GLUCOSEE


Ce milieu présente des formules différentes selon l’emploi qu’il en est fait.

La première formule est utilisée comme milieu de base pour les cas généraux dans la recherche des Bacillus thermophiles .
Les Bacillus thermophiles sont des micro-organismes sporulés, GRAM positif en culture jeune, se développant en aérobiose à 55°C, catalase positive (bien que certaines souches donnent une catalase faible ou tardive), lorsque l’essai est exécuté selon la norme.

Il fait l’objet d’une recommandation dans le norme AFNOR NF V 08-404.

La deuxième formule est préconisée comme milieu de confirmation ( essai de fermentation) dans les directives générales pour la recherche des Enterobacteriaceae après pré-enrichissement – Norme AFNOR 08-025 (ISO 8523).

FORMULE (en g/l d'eau distillée)


1ère formule
Tryptone: 4
Tryptose: 4
Sojatone: 3
Extrait de levure: 4
Sodium chlorure: 5
Glucose: 5
Amidon soluble: 1
Agar 12 à 18*
pH= 6.1


* selon le pouvoir gélifiant de l’agar.
Dissoudre les composants et ajuster le pH.
Dans le cas de l’étude de produits à pH<4,5, le pH peut être ajusté, après stérilisation, avec de l’acide lactique ou citrique.
Répartir le milieu de culture par quantités de 10 ml dans des tubes.
Stériliser à 121°C pendant 15 min.

2ème formule
Tryptone: 10.000
Extrait de levure: 1.500
Glucose: 10.000
Sodium chlorure: 5.000
Bromocresol pourpre:0.015
Agar 8 à 18*
pH= 6.1


*selon pouvoir gélifiant de l’agar
Dissoudre les ingrédients en chauffant si nécessaire.
Répartir le milieu de culture par quantités de 15 ml dans des tubes.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 20 min.

Maintenir les tubes en position verticale.

Le milieu peut être conservé 1 semaine au maximum entre 0°C et +5°C.

Juste avant emploi, chauffer dans de l’eau bouillante ou sous courant de vapeur pendant 15 minutes, puis refroidir rapidement à la température d’incubation.

UTILISATION


1) Recherche des bacillus thermophiles (NF V08-4-404)

Les essais préliminaires pour la recherche des Bacillus thermophiles sont spécifiés dans Bouillon Glucosé p. 25. A partir des tubes de bouillon glucosé positifs, effectuer :
• Essai de culture en aérobiose et recherche de la catalase
A partir des milieux de culture ensemencés (formes végétatives et/ou sporulées) présentant un développement microbien, ensemencer en stries deux boîtes de Petri de milieu de culture gélosé ( de préférence milieu au jus de tomate) l’une après l’autre en se servant de la même anse.

Incuber à 55°C pendant 18 à 24 heures
Observer la présence ou l’absence de colonies. Les souches de Bacillus thermophiles ont parfois des difficultés de croissance, ce qui peut rendre l’observation des colonies difficile.

Lorsqu’il y a présence de colonies, les repérer selon leur type morphologique, émulsionner une colonie isolée, pour chaque type, dans un tube à hémolyse contenant 1 ml d’eau stérile ; y ajouter 2 à 3 gouttes du réactif pour la recherche de la catalase. La formation de bulle de gaz indique la présence d’une catalase.

2) Recherche des Enterobacteriaceae (NF V08-025)
A partir des colonies caractéristiques prélevées sur VRBG et amplifiées sur gélose nutritive, les essais de confirmation sont effectués :
- essai à l’oxydase,
- essai de fermentation : repiquer les souches sélectionnées par piqûre à l’aide d’un fil droit dans les tubes de milieu glucosé.
Incuber pendant 24 heures à 35°C ou 37°C (selon accord).
Si une couleur jaune se développe dans la totalité du contenu du tube, la réaction est considérée comme positive.

Expression des résultats
Si l’une des colonies caractéristiques est oxydase-négative et glucose-positive, la prise d’essai doit être considérée comme renfermant des Enterobacteriaceae.
Selon les résultats obtenus aux essais de confirmation, indiquer « présence ou absence d’Enterobacteriaceae, selon la quantité examinée dans x g de produit ».


GELOSE NUTRITIVE


La gélose nutritive est un milieu qui convient à la culture des germes ne présentant pas d’exigences particulières.

C’est un milieu particulièrement recommandé dans les normes française pour les repiquages des colonies caractéristiques à partir des milieux sélectifs (exemple : norme NF V08-017 relative aux directives générales pour le dénombrement des coliformes fécaux et d’Escherichia coli : repiquage sur gélose nutritive des colonies caractéristiques obtenues sur EMB, afin de réaliser ultérieurement le test IMViC).


FORMULE (en g/l d'eau distillée)


Peptone: 5
Extrait de viande: 1
Extrait de levure: 2
Sodium chlorure: 5
Agar: 12
pH=7.4


Distribuer en tubes ou en flacons.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.

NB : On se méfiera des appellations commerciales : sous des noms presque identiques :Bouillon nutritif peptoné, gélose nutritive, Bouillon nutritif n°2 , etc., se cachent des formules très différentes ; en revanche, des milieux de formules identiques peuvent être commercialisées par plusieurs firmes sous des appellations diverses.
Il faut lire attentivement la formule d’un milieu avant d’en faire le choix, afin d’envisager non seulement les possibilités mais aussi les limites d’utilisation.


GÉLOSE SULFITÉE AU CITRATE DE FER


Ce milieu est préconisé comme milieu de base pour les cas généraux dans la recherche des Clostridium thermophiles dans les conserves
Les Clostridium thermophiles sont des microorganismes sporulés se développant uniquement en anaérobiose à la température de 55°C, lorsque l’essai est réalisé selon la norme.
Il fait l’objet d’une recommandation dans la norme AFNOR NF V 08-405.

FORMULE (en g/l d'eau distillée)


Tryptone: 10.0
Sodium métabisulfite: 0.5
Fer citrate: 0.5
Agar 12 à 18*
pH= 7.2


*selon pouvoir gélifiant de l’agar.
Dissoudre les composants et ajuster le pH avec de l’acide lactique ou de l’acide citrique.
Répartir le milieu de culture par quantités de 12 ml dans des tubes.
Stériliser à 121°C pendant 15 min.

UTILISATION ET LECTURE


Juste avant emploi, régénérer les tubes au bain-marie bouillant pendant 20 minutes. Laisser refroidir à environ 45°C.

Recherche des Clostridium thermophiles (NF V 08-405)
- Recherche des formes végétatives
On utilise généralement 1 g ou 1 ml de produit pour 10 ml de milieu.
Ensemencer à raison de trois tubes par milieu de culture préalablement désaéré, puis refroidir rapidement dans un bain d’eau froide après avoir homogénéisé l’inoculum dans le milieu sans y introduire de l’air.

- Recherche des formes sporulées
Ensemencer comme précédemment puis plonger pendant 10 minutes les tubes dans un bain d’eau bouillante.
Il convient de veiller à ce que le niveau de l’eau du bain soit supérieure au niveau du milieu de culture dans les tubes.
Retirer ensuite les tubes et les refroidir sous courant d’eau froide.
Cette technique a été choisie en raison de sa facilité et de son efficacité : toute croissance bactérienne est due à la présence de spores thermorésistantes dans l’inoculum.

- Incubation des milieux de culture
Placer les tubes de milieu de culture ensemencés à l’étuve à 55°C.

- Lecture
Observer chaque jour les tubes, afin de déceler l’apparition de culture. En l’absence de culture, prolonger l’incubation pendant 8 jours.
Sortir les tubes de l’étuve dès l’apparition de colonies dans la gélose (colonies noires s’il s’agit de D. nigrificans.):

- Résultats des ensemencements
CAS 1 : aucun développement de bacilles n’est mis en évidence dans les milieux de culture ensemencer : pas d’essai de confirmation à effectuer
Absence de Clostridium thermophiles

CAS 2 : aucun développement dans la recherche des formes végétatives, mais un développement est mis en évidence dans la recherche des formes sporulées : effectuer les essais de confirmation sur la mise en évidence du caractère anaérobie

CAS 3 : un développement est mis en évidence dans la recherche des formes végétatives, mais aucun développement dans la recherche des formes sporulées : effectuer les essais de confirmation sur la mise en évidence de l’aptitude à la sporulation ainsi que ceux sur la mise en évidence du caractère anaérobie.

CAS 4 : Un développement est mis en évidence dans les deux recherches (formes végétatives et sporulées) : effectuer à partir de la recherche des formes végétatives tous les essais de confirmation et à partir de la recherche sur les formes sporulées, les essais de confirmation sur la mise en évidence du caractère anaérobie
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MessageSujet: Re: G   Ven 19 Oct - 4:09

- Essais de confirmation[/u]

• mise en évidence de l’aptitude à la sporulation
A partir de chaque tube ensemencé pour la recherche des formes végétatives présentant un développement microbien, ensemencer un tube de Gélose sulfitée au citrate de fer et procéder comme pour la recherche des formes sporulées.
Incuber à 55°C pendant 24 heures à 8 jours si nécessaire.
Procéder à la lecture. L’apparition d’une culture traduit l’aptitude à la sporulation des formes bacillaires observées dans les milieux de culture pour la recherche des formes végétatives.

• Mise en évidence du caractère anaérobie
Repérer les colonies se développant au fond du tube, selon leur type morphologique.
Repiquer une colonie isolée pour chaque type morphologique dans un milieu liquide stérile (Rosenow cystéiné ou bouillon glucosé), préalablement désaéré, puis recouvrir chaque tube avec de l’huile de vaseline stérile , de la paraffine ou de la gélose blanche préalablement fondues. Incuber à 55°C. En l’absence de culture, prolonger l’incubation pendant 8 jours.
Lorsqu’il y a apparition d’une culture ensemencer en stries, avec une anse, à partir de chaque culture, la surface d’une boîte de gélose Columbia.
(Voir UTILISATION ET LECTURE à Gélose Columbia p 56)

- Résultats et interprétation*


CAS 2 :
- Pour au moins un type morphologique isolé, une culture en anaérobiose est obtenue, sans culture en aérobiose, conclure :
Présence de Clostridium thermophiles
- Pour tous les types morphologiques isolés, une culture en aérobiose est obtenue, conclure :
Absence de Clostridium thermophiles


CAS 3
- Un développement de bacilles est mis en évidence lors de l’essai de la sporulation, et pour au moins un type morphologique isolé, une culture en anaérobiose est observée et aucune culture n’est obtenue en aérobiose, conclure :
Présence de Clostridium thermophiles
Remarque :il convient de s’assurer, dans ce cas, qu’il s’agit de la même souche.
Dans le cas contraire, conclure
« Présence de Clostridium thermophiles, dont l’aptitude à la sporulation n’a pu être démontré dans les conditions de l’essai »

- Un développement de bacilles est mis en évidence lors de l’essai de la sporulation, et pour tous les types morphologiques isolés, une culture en aérobiose est obtenue, conclure :
Absence de Clostridium thermophiles

- Aucun développement de bacilles n’est mis en évidence lors de l’essai de sporulation, mais pour tous les types morphologiques isolés, une culture en aérobiose est obtenue, conclure :
Absence de Clostridium thermophiles

- Aucun développement de bacilles n’est mis en évidence lors de l’essai de la sporulation et pour au moins un type morphologique isolé, une culture en anaérobiose est observée et aucune culture n’est obtenue en aérobiose, conclure :
Présence de Clostridium thermophiles dont l’aptitude à la sporulation n’a pu être démontrée dans les conditions de l’essai


CAS 4
- A partir des tubes positifs pour la recherche des formes sporulées, et pour au moins un type morphologique isolé, une culture en anaérobiose est observée et aucune culture n’est obtenue en aérobiose, conclure :
Présence de Clostridium thermophiles

- A partir des tubes positifs pour la recherche des formes sporulées, pour tous les types morphologiques isolés, une culture en anaérobiose est obtenue. Utiliser alors les résultats des essais effectués à partir des tubes pour la recherche des formes végétatives. Lire et interpréter comme dans le cas 3.


GIOLITTI ET CANTONI Bouillon


Le bouillon de Giolitti et Cantoni est un milieu d’enrichissement sélectif simple concentration pour la recherche de Staphylococcus aureus dans les produits alimentaires.

MOSSEL, HARREWIJN et ELZEBROCK ont recommandé le milieu précédemment formulé par GIOLITTI et CANTONI en 1966 pour la mise en évidence de Staphylococcus aureus dans les poudres de lait et les aliments infantiles.

Le pyruvate, la glycine et surtout le mannitol favorisent le développement des staphylocoques.
Les germes Gram-négatifs sont inhibés par le chlorure de lithium et les micro-organismes Gram-positifs par le tellurite.
L’environnement anaérobie supprime la croissance des microcoques.
Le développement des staphylocoques se manifeste par l’apparition d’une coloration noire qui est due à la réduction du tellurite en tellure métallique.

Ce milieu est recommandé pour le dénombrement de Staphylococcus aureus dans les produits laitiers secs, par la méthode du nombre le plus probable (Norme FIL Internationale 60B).

FORMULE (en g/l d'eau distillée)

A) milieu de base

Le milieu s’utilise en simple ou double concentration
- SC
Tryptone: 10.00
Extrait de viande: 5.00
Extrait autolytique de levure: 5.0
Glycine: 1.2
Mannitol: 20.0
Sodium pyruvate : 3.0
Sodium chlorure: 5.0
Lithium chlorure : 5.0
Tween 80: 1.0

-DC
Tryptone: 20.00
Extrait de viande: 10.00
Extrait autolytique de levure: 10.0
Glycine: 2.4
Mannitol: 40.0
Sodium pyruvate : 6.0
Sodium chlorure: 10.0
Lithium chlorure : 10.0
Tween 80: 2.0
ph= 6.9



Dissoudre les ingrédients et porter à ébullition en agitant.
Répartir le milieu par quantités de 10 ml dans des tubes de capacité appropriée
Stériliser à l’autoclave à 115°C pendant 20 minutes.

B) solution de tellurite de potassium
Préparer une solution de tellurite de potassium à 1% dans l’eau distillée. Dissoudre le tellurite en chauffant au minimum.
Stériliser par filtration.
La solution peut être conservée pendant plusieurs mois entre 0 et +5°C.

C) Milieu complet
Peu avant l’utilisation, chauffer le milieu de base pendant 20 minutes à 100°C pour chasser l’air.
Refroidir à 45°C et ajouter aseptiquement la solution de tellurite de potassium en utilisant 0,1 ml/tube pour le milieu simple concentration et 0,2 ml/tube pour le milieu double con,centration.

UTILISATION ET LECTURE

Prendre trois tubes de milieu double concentration auxquels on a rajouté le tellurite de potassium et transférer dans chaque tube 10 ml de la première dilution (correspondant à 1 g d’échantillon).

Prendre trois tubes de milieu simple concentration auxquels on a rajouté le tellurite de potassium et transférer dans chacun de ces tubes 1 ml de la première dilution (correspondant à 0,1 g d’échantillon).

Pour chacune des dilutions suivantes correspondant à 0,01, 0,001, 0,0001g) procéder comme ci-dessus sur milieu simple concentration à l’aide d’une nouvelle pipette entre chaque dilution.
Mélanger soigneusement l’inoculum et le milieu, en évitant l’introduction d’air.
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