MILIEUX DE CULTURE MICROBIO ALIMENTAIRE

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Date d'inscription : 21/09/2006

MessageSujet: O   Ven 26 Oct - 8:58

O.G.A. (Gélose glucosée à l’oxytétracycline)



L’agar glucosé à l’oxytétracycline (O.G.A.) est utilisée pour la recherche et le dénombrement des Levures et des Moisissures dans les produits alimentaires. Il peut être appelé Oxytétracycline Glucose Yeast Agar ou O.G.Y.A.

En 1965, BUTTIAUX et CATSARAS ont recommandé l’emploi de ce milieu pour la recherche des levures et des moisissures dans les bières ; puis SAINTCLIVIER et ROBLOT pour l’analyse du beurre. MOSSEL a également démontré que sur plusieurs types d’aliments, un milieu à pH neutre permettrait d’obtenir une meilleure récupération qu’un milieu à bas pH.

Ce milieu est préconisé dans la norme NF V 03-454 axée sur le dénombrement des levures et des moisissures dans les épices et les aromates.


FORMULE (en g/l d’eau distillée) .

Extrait de levure déshydratée: 5
Glucose: 20
Agar: 16 à 24
pH = 6,8


Chauffer lentement, en agitant fréquemment, puis porter à ébullition jusqu’à complète dissolution.
Répartir en flacon de 150 ml, à raison de 100 ml par flacon.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 20 minutes.

- Solution d’oxytétracycline
Oxytétracycline 0,1 g
Eau 100 ml
Dissoudre l’oxytétracycline dans l’eau. Filtrer cette solution sur membrane filtrante.
Répartir en tubes ou en fioles stériles et conserver à 4°C.

- Milieu complet
Au moment de l’emploi, faire fondre complètement le milieu de base au bain marie ou au micro ondes. Refroidir à 45/48°C.
Ajouter, à 100 ml de milieu de base fondu, 1 ml de la solution d’oxytétracycline.
Bien mélanger et couler en boîtes de Petri.
Après solidification, sécher la surface du milieu à l’étuve à 55°C, couvercle entrouvert et laisser refroidir couvercle fermé.

UTILISATION ET LECTURE

Introduire la prise d’essai et ajouter le volume correspondant de diluant
Préparer deux tubes de dilutions au 1/100 préparés à partir de la suspension-mère et préparer une dilution au 1/1000 à partir de ces tubes. Opérer de même pour les dilutions suivantes.
Prendre 4 boîtes de Petri contenant du milieu OGA.

Transférer à la surface de chaque boîte, à l’aide d’une pipette stérile, 0,1 ml de la suspension mère au 1/10.
Etaler sur toute la surface du milieu à l’aide d’un étaleur stérile.
Prendre deux autres boîtes de milieu OGA, transférer à la surface de chaque boîte, à l’aide d’une nouvelle pipette stérile, 0,1 ml de la dilution au 1/100 prélevé dans le premier tube de dilution au 1/100 après l’avoir agité.

Etaler sur toute la surface du milieu avec l’étaleur.
Recommencer les mêmes opérations avec le deuxième tube de dilution au 1/100.
Opérer de la même manière avec les éventuelles dilutions suivantes.

NB : Il peut être utile, dans certains cas, de pratiquer un ensemencement en profondeur. Déposer alors 1 ml de la suspension mère ou de ses dilutions et recouvrir avec le milieu en surfusion.

Incuber les boîtes ainsi préparées fermées, couvercle en dessous, pendant 5 jours dans l’étuve réglée à 20-25°C.

Repérer les colonies sur les boîtes de préférence tous les jours à partir du deuxième jour d’incubation.

Dénombrer les colonies de levures et les colonies de moisissures en choisissant les boîtes qui contiennent au total 10 à 100 colonies. S’aider d’un appareil grossissant approprié.

EXPRESSION DES RESULTATS

A la suite des opérations de dénombrement, les quatre boîtes se situent, au plus, au niveau de deux taux de dilution différents:
- Si les quatre boîtes ont le même taux de dilution, calculer la moyenne arithmétique du nombre de colonies dénombrées dans ces boîtes ; si le résultat est un nombre de 3 chiffres, l’arrondir à la dizaine près. Si le chiffre des unités est 5, arrondir à la dizaine paire près. Multiplier par le facteur de dilution pour obtenir le nombre de levures et de moisissures par gramme d’épice.

- Si les quatre boîtes n’ont pas le même taux de dilution, faire la moyenne arithmétique du nombre de colonies pour chaque taux. Arrondir comme ci-dessus les deux nombres ainsi obtenus. Les rapporter au gramme en les multipliant par le facteur de dilution correspondant, et en faire la moyenne pour obtenir le nombre moyen de levures et de moisissures par gramme d’épice.

Donner comme résultat le nombre de levures et de moisissures par gramme d’épice. L’exprimer par un nombre compris entre 0,1 et 9,9 multiplié par la puissance appropriée de 10 (par exemple un nombre moyen de 15000 serait indiqué par : 1,5 x 104 par gramme).


OLSON Gélose



Le milieu de Olson est employé pour mettre en évidence les Pseudomonas pigmentés.

Nous pouvons l’assimiler aux milieux de King A et King B supplémentés en violet cristal. Il exalte la pigmentation tout en inhibant le développement des bactéries Gram-positives.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
Protéose peptone n°3: 20
Glycérol: 10
Di-potassium hydrogénophosphate: 1.5
Magnésium sulfate, 7 H2O: 1.5
Violet cristal: 0.002
Agar: 15
pH = 7,2


Stériliser 30 minutes à 110°C.


OXFORD- CURTIS Gélose



Le milieu d’Oxford Curtis est un milieu sélectif mis au point en 1988 par CURTIS G.D.W., MITCHELL M.G., KING A.F. et GRIFFIN E.J. pour l’isolement et la mise en évidence de Listeria monocytogenes tout en inhibant la flore secondaire gram-négative et la plus grande partie de la flore Gram-positive. Il est recommandé dans la norme NF V 08-055 dans la méthode de routine pour la recherche de cette bactérie et dans la méthode de dénombrement de Listeria monocytogenes dans les produits végétaux ou d’origine végétale (BOCCRF du 30 mai 1992 rectifié le 5 septembre 1992).

Dans le cadre d’une recherche sur les laits de consommation et les produits à base de lait , il est recommandé par un avis émanant du Ministère de l’Agriculture, de la Pêche et de l’Alimentation, d’utiliser le milieu Oxford pour les produits à faible flore contaminante (fromage au lait traité thermiquement), alors que le milieu Palcam sera préféré pour les produits à forte flore contaminante (fromage au lait cru) et que les deux milieux seront utilisés si la nature de l’aliment à analyser n’est pas connu.

La sélectivité du milieu repose sur sa teneur en chlorure de lithium, sulfate de colistine, acriflavine, céfotétane, cyclohéximine et fosfomycine.

Listeria monocytogenes dégrade l’esculine contenue dans le milieu en glucose et en esculétine, dont la dernière, forme avec les ions fer (III) un composé complexe vert olive à noir qui colore ensuite les colonies de Listeria monocytogenes.

Le supplément sélectif pour Listeria Oxford est un mélange de cinq antibiotiques sous forme lyophilisée.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
1) Milieu de base

Peptone: 23
Amidon: 1
Sodium chlorure: 5
Esculine: 1
Fer (III) ammonium citrate : 0.5
Lithium chlorure: 15
Agar: 13,0
pH = 7,2


Dissoudre la quantité nécessaire de produits pour 500 ml d’eau distillée et chauffer au bain-marie bouillant jusqu’à dissolution complète.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Refroidir à 50°C.

2) Supplément sélectif

Cycloheximide: 200 mg
Sulfate de colistine: 10 mg
Acriflavine: 2.5 mg
Céfotétane: 1 mg
Fosfomycine: 5 mg
pH = 7,2


Dissoudre le lyophilisat dans le flacon d’origine en ajoutant 5 ml d’un mélange stérile éthanol/eau selon 1/1. Mélanger de façon homogène en agitant avec précaution.


UTILISATION ET LECTURE

Après enrichissement primaire sur bouillon Fraser demi, ensemencer avec une anse la surface d’une gélose Oxford. Procéder de même après enrichissement secondaire sur bouillon Fraser ( incubation 18 h à 24 h) et renouveler l’opération à partir du même bouillon incubé 42 h à 48 h
Inoculer en surface par étalement et incuber le milieu à 37°C.

Dans le cadre de la méthode de dénombrement de Listeria monocytogenes dans les produits végétaux ou d’origine végétale, l’ensemencement s’effectue avec 0,1 ml d’échantillon si le produit est liquide ou 0,1 ml de la suspension mère si le produit est solide. Etaler à la surface d’une boîte bien sèche et/ou une boîte de Milieu d’isolement de Mox et/ou de Palcam. Répéter cette opération avec les dilutions suivantes.


Etaler le plus rapidement possibleet laisser sécher les boîtes environ 15 minutes à la température ambiante.
Examiner chacune des boîtes d’isolement après 18 à 24 heures et si nécessaire 48 h d’incubation.

Listeria monocytogenes pousse en colonies brun gris avec un halo noir (dégradation de l’esculine). Après 48 heures d’incubation, les colonies typiques ont un diamètre d’environ 2 mm, sont incrustées dans la gélose et présentent une dépression centrale.

Dans la méthode de dénombrement ne retenir que les boîtes contenant entre 15 et 150 colonies.
Sélectionner cinq colonies typiques sur chaque boîte. S’il y en a moins de cinq, les retenir toutes. Repiquer chaque colobie sur milieu T.S.A.Y.E.

Il est conseillé de procéder à des tests complémentaires morphologiques, physiologiques et biochimiques (galerie de tubes ou galeries miniaturisée, catalase, coloration de Gram, mobilité, test de CAMP, hémolyse, fermentation du xylose et du rhamnose) .
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