MILIEUX DE CULTURE MICROBIO ALIMENTAIRE

manuel de milieux de culture
 
AccueilFAQRechercherS'enregistrerMembresGroupesConnexion

Partagez | 
 

 L

Voir le sujet précédent Voir le sujet suivant Aller en bas 
AuteurMessage
Admin
Admin


Nombre de messages : 37
Date d'inscription : 21/09/2006

MessageSujet: L   Jeu 25 Oct - 5:58

LACHICA



Chez Staphylococcus aureus, il a été démontré une corrélation entre la production d’entérotoxines, dans le cas de toxi-infections, et celle de thermonucléase. La plupart (98,3%) des souches entérotoxiques se révèlent être productrices de thermonucléases.

La méthode proposée est une modification du test métachromatique de diffusion en gélose.

Le milieu de Lachica a une teinte bleu-nuit. Lors de l’hydrolyse enzymatique de l’ADN, le colorant n’est plus lié qu’à l’agar et une couleur rose apparaît.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Acide désoxyribonucléique: 0.3
Calcium chlorure: 0.011
Sodium chlorure: 10
Tampon Tris: 6.10 ml
Bleu de toluidine à 1%: 9.20 ml
Agar: 12
pH = 8,6


NE PAS AUTOCLAVER.
Répartir en boîtes de Pétri.

UTILISATION

Prélever une colonie à partir des boîtes suspectées (Baird-Parker, Chapman), inoculer dans un tube contenant 2 ml de coeur-cervelle. Incuber à 37°C pendant 3-4 heures.
Porter les tubes au bain-marie bouillant et chauffer 15 minutes. De cette façon le test sera spécifique pour la DNase thermorésistante de St. aureus.

Le milieu de Lachica, coulé en boîte de Petri, aura été au préalable creusé de puits , à l’emporte-pièce (5 à 6 puits de 3 mm de diamètre sur le pourtour et un puits central pour un témoin positif).
Remplir les puits à l’aide de l’échantillon refroidi, avec une pipette Pasteur.

Attendre quelques minutes pour permettre aux échantillons d’être partiellement absorbés par le milieu.
Incuber les boîtes à 37°C pendant 4-6 heures ou 50°C pendant 3-4 heures.

Ne pas retourner les boîtes.


LECTURE

Le test est positif, quant à la présence de thermonucléase si une zone rose apparaît autour des puits contenant les échantillons et le contrôle positif.



LACTOSE GELATINE



Ce milieu s’inscrit dans le code normatif au niveau de la confirmation de Clostridium perfringens lors de son dénombrement.

Il sert à mettre en évidence la fermentation du lactose et l’activité gélatinase sur des souches isolées à partir du milieu TSC.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
Tryptose: 15
Extrait de levure: 10
Lactose: 10
Gélatine: 120
Rouge de phénol: 0.05
pH = 7,5


Dissoudre les composants à l’exception du lactose et du rouge de phénol dans l’eau.
Ajuster le pH.
Ajouter le lactose et le rouge de phénol, répartir en tubes.
Stériliser à 121°C pendant 15 minutes.
Conserver au réfrigérateur à +4°C.
Ne pas utiliser le milieu plus de trois semaines après sa préparation.


UTILISATION ET LECTURE

Régénérer avant emploi et refroidir à la température d’incubation.
Après ensemencement, incuber, pour les Clostridium en anaérobiose à 35°C (ou 37°C) pendant 24 heures.

- fermentation du lactose : elle se traduit par le virage de l’indicateur coloré au jaune ; détecter la présence de gaz.

- gélatinase : refroidir les tubes pendant 1 heure à 4-5°C et vérifier s’il y a liquéfaction de la gélatine. Si le milieu est solidifié, réincuber durant 24 heures supplémentaires et vérifier de nouveau s’il y a liquéfaction de la gélatine.


LACTOSE GLUTAMATE DE SODIUM CHLORURE D’AMMONIUM Bouillon



Ce milieu est un milieu de culture sélectif utilisé pour la recherche des coliformes dans la gélatine alimentaire. Il est conforme à la norme NF V 59-102 relative à cette recherche par la méthode par culture à 30°C sur milieu sélectif liquide.
Il est également utilisé, toujours pour la gélatine alimentaire pour la recherche des coliformes fécaux (NF V 59-103 : méthode par culture à 44,5°C sur milieu sélectif liquide.


FORMULE
.
Ce milieu s’utilise sous forme simple concentration pour la recherche des « coliformes » et sous forme double et simple concentrations pour la recherche des coliformes fécaux .

- Simple concentration (SC)
Lactose: 10
Sodium glutamate: 6.35
Sodium formate: 0.25
L. cystine: 0.02
L (-) acide aspartique: 0.024
L(+) arginine: 0.02
Thiamine: 0.001
Acide nicotinique: 0.001
Acide pantothénique: 0.001
Magnésium sulfate: 0.1
Fer (III) ammonium citrate: 0.01
Calcium chlorure: 0.01
Di-potassium hydrogénophosphate: 0.090
Pourpre de bromocrésol: 0.01
Ammonium chlorure à 2,5 g/l d’eau: 1000 ml

-double concentration (DC)
Lactose: 20
Sodium glutamate: 12.7
Sodium formate: 0.50
L. cystine: 0.04
L (-) acide aspartique: 0.048
L(+) arginine: 0.04
Thiamine: 0.002
Acide nicotinique: 0.002
Acide pantothénique: 0.002
Magnésium sulfate: 0.2
Fer (III) ammonium citrate: 0.02
Calcium chlorure: 0.02
Di-potassium hydrogénophosphate: 0.18
Pourpre de bromocrésol: 0.02
Ammonium chlorure à 5 g/l d’eau: 1000 ml
pH = 6,7


Dissoudre les composants dans le chlorure d’ammonium.
Répartir le milieu simple concentration dans des fioles à raison de 50 ml par fiole et le milieu double concentration dans des fioles à raison de 100 ml environ par fiole.
Ajouter dans chaque fiole de milieu simple concentration une cloche de Durham et deux cloches dans le milieu double concentration.
Stériliser à l’autoclave à 116°C pendant 10 min. Laisser refroidir les flacons à température ambiante.
Les cloches ne doivent pas contenir de bulles d’air.


UTILISATION ET LECTURE
Recherche des « coliformes » (NF V 59-102)
Prendre une fiole contenant 50 ml de milieu et transférer aseptiquement 10 ml de la solution d’essai à l’aide d’une pipette stérile.

Mélanger soigneusement l’inoculum au milieu de culture en agitant doucement par des mouvements circulaires et en évitant toute arrivée d’air dans la cloche.

Placer la fiole pendant 48+/- 2 h dans l’étuve réglée à 30°C.

Après la période d’incubation, examiner la fiole pour noter la présence ou l’absence de gaz dans la cloche de Durham.
La présence de gaz toujours accompagnée d’une abondante culture de micro-organismes traduite par un louchissement et/ou un jaunissement du milieu de culture, correspond à la présence d’au moins un « coliforme » dans la quantité de gélatine ensemencée.
L’absence de gaz correspond à l’absence de coliforme dans cette même quantité de gélatine.

Dans le premier cas, donner le résultat sous la forme de :
Absence de « coliformes » obtenus à 30°C dans 1 g de gélatine.

Dans le second cas, donner le résultat sous le forme :
Présence de « coliformes obtenus à 30°C dans 1g de gélatine.


Recherche des coliformes fécaux (NF V 59-103)
Avant de commencer l’analyse, préchauffer le milieu en mettant la fiole pendant 10 à 20 minutes au bain-marie réglé à 44,5°C.

Effectuer la prise d’essai et préparer la solution d’essai au 1/10. Prendre une fiole contenant 100 ml de milieu de culture liquide double concentration et munie de deux cloches de Durham et transférer aseptiquement 100 ml de la solution d’essai à l’aide d’une éprouvette stérile.

Mélanger soigneusement l’inoculum au milieu de culture en agitant doucement par mouvements circulaires et en évitant toute arrivée d’air dans la cloche.

Placer la fiole pendant 48+/- 2 h dans l’étuve ou un bain d’eau réglé à 44,5°C.

Après la période d’incubation, examiner la fiole pour noter la présence ou l’absence de gaz dans la cloche de Durham.
S’il y a un dégagement gazeux dans l’une ou les deux cloches, repiquer la culture dans un milieu simple concentration, muni d’une cloche de Durham.

Incuber à 44,5°C pendant 48+/- 2 h.

Après la période d’incubation, examiner la fiole pour noter la présence ou l’absence de gaz dans la cloche de Durham.

La présence de gaz toujours accompagnée d’une abondante culture de micro-organismes traduite par un louchissement et/ou un jaunissement du milieu de culture, correspond à la présence d’au moins un micro-organisme du groupe des « coliformes fécaux » dans la quantité de gélatine ensemencée.
L’absence de gaz correspond à l’absence de micro-organismes du groupe des « coliformes fécaux » dans cette même quantité de gélatine.

S’il n’y a aucun dégagement gazeux dans les cloches de Durham de la fiole de milieu double concentration, donner le résultat sous la forme :
Absence de « coliformes fécaux » dans 10 g de gélatine.

S’il y a un dégagement gazeux dans les cloches de Durham de la fiole de milieu double concentration et
- s’il y a absence de dégagement gazeux dans la cloche de Durham du milieu simple concentration, donner le résultat sous la forme :
Absence de « coliformes fécaux » obtenus dans 10 g de gélatine.

- s’il y a dégagement gazeux dans la cloche de Durham du milieu simple concentration, donner le résultat sous la forme :
Présence de « coliformes fécaux » obtenus dans 10 g de gélatine.


LACTOSE HYPERSALE Bouillon



Ce milieu est préconisé dans le recherche de Staphylococcus aureus dans la gélatine alimentaire (NF V 59-105) . Il constitue dans ce cadre un milieu d’enrichissement sélectif liquide.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
Extrait de viande de bœuf: 3
Peptone de caséine ou tryptone: 5
Protéose peptone: 5
Lactose: 7.5
Sodium chlorure: 75
Agar: 0.5
pH = 7,4


Dissoudre les composants et porter le milieu à ébullition.
Répartir dans des tubes à raison de 19 ml par tube.
Stériliser à 1231°C pendant 20 minutes.

Le milieu peut être conservé 1 mois entre 0 et +5°C.


UTILISATION ET LECTURE

Effectuer la prise d’essai et préparer la solution d’essai au 1/10.
Dans un tube contenant 10 ml de milieu lactosé hypersalé transférer 1 ml de la solution d’essai à l’aide d’une pipette stérile. Homogénéiser.

Placer le tube ensemencé pendant 48 2 h

A partir du tube incubé, ensemencer par stries, une anse du contenu à la surface d’un milieu Baird Parker coulé en boîte de Petri.


LACTOSE SULFITE



Le milieu Lactose sulfite. peut être utilisé pour la recherche ou le dénombrement de Clostridium perfringens par la technique du Nombre le Plus Probable.

Il est recommandé dans la norme NF V 08-056 pour le dénombrement de Clostridium perfringens par comptage des colonies à 37°C ainsi que dans la norme NF V 59-107 relative à la recherche des spores de Clostridium perfringens dans la gélatine alimentaire.

L’utilisation du lactose entraîne la production de gaz (recueilli dans une cloche de Durham) et de H2S (formation d’un précipité noir de sulfure de fer).


FORMULE (en g/l d’eau distillée)

A) Milieu de base
Peptone trypsique de caséine: 5
Extrait de levure: 2.5
Sodium chlorure: 2.5
Lactose: 10
Chlorhydrate de cystéine: 0.3
pH = 7,1


Répartir 8 ml par tube ou 80 ml par fiole contenant une cloche de Durham.
Stériliser 15 mn à 121°C.
Régénérer le milieu avant addition des suppléments.

B) Milieu de détection

Ajouter 0,5 ml d’une solution à 0,8% de métabisulfite de sodium anhydre (concentration finale 0,04%) et 0,5 ml d’une solution à 1% de citrate de fer ammoniacal, stérilisés par filtration, dans les tubes de milieu de base et/ou 5 ml de chacun de ces deux réactifs dans les fioles de milieu de base.

C) Milieu de confirmation

Ajouter 0,5 ml d’une solution à 1,2% de métabisulfite de sodium anhydre (concentration finale 0,06%) et 0,5 ml d’une solution à 1% de citrate de fer ammoniacal dans les tubes de milieu de base et/ou 5 ml de chacun de ces deux réactifs dans les fioles de milieu de base.

UTILISATION ET LECTURE

Régénérer les milieux en les mettant au bain-marie bouillant pendant 10 minutes.
Ensemencer les tubes de milieu de détection avec 1 ml du produit à analyser et avec 1 ml de chacune des dilutions.
Incuber à 46°C; observer la production de gaz et de sulfure de fer. Dès que la production de gaz apparaît, repiquer une goutte de culture dans un tube de milieu de confirmation. Incuber à 46°C.

En quelques heures, la présence de Clostridium perfringens se traduit par un précipité de sulfure de fer puis l’apparition de gaz. Les résultats sont exprimés en nombre de Cl. perfringens par millilitre ou milligramme de produit.

- Dans la cadre de la norme NF V 08-056 le milieu lactose sulfite sert à la confirmation biochimique. A partir des colonies caractéristiques repiquées sur milieu thioglycholate liquide, ensemencer un tube de lactose sulfite ( 5 gouttes).
Incuber à 46°C pendant 24 h ± 2 heures.

Les bactéries qui se développent en produisant du gaz (1/3 au moins de la cloche de Durham) et en formant un précipité noir de sulfure de fer, sont considérées comme étant des Clostridium perfringens.
En cas de doute, ensemencer, dans un délai inférieur à 24 h un nouveau tube de lactose-sulfite avec cinq gouttes de la culture précédente.

- Dans le cadre de la norme NF V59-107, le milieu de confirmation en flacon est ensemencé avec 10 ml de la solution obtenue sur diluant cystéiné et traitée préalablement 10 minutes à 80°C. Eviter l’introduction d’air et mélanger par mouvements circulaires larges.
Placer le flacon ensemencé dans un bain d’eau réglé à 46°C pendant 24 h ou éventuellement 48h.
Après la période d’incubation, examiner la fiole et noter la présence à la fois de gaz dans la cloche de Durham et la formation d’un précipité noir de sulfure de fer
Dans le cas ou la quantité de gaz ou la quantité de précipité de sulfure est insuffisant, repiquer 1 ml de culture dans un tube de LS.

• s’il n’y a pas de dégagement gazeux ou pas de précipité , ou ni gaz ni précipité dans la fiole ou dans le tube provenant du repiquage de la fiole, le résultat est :
Absence de « spores de Clostridium perfringens » dans 1 g de gélatine
• s’il y a un dégagement gazeux dans la fiole ou dans le tube provenant du repiquage de la fiole , le résultat est
Présence de « spores de Clostridium perfringens " dans 1 g de gélatine


Dernière édition par le Jeu 25 Oct - 8:19, édité 1 fois
Revenir en haut Aller en bas
Voir le profil de l'utilisateur http://microbioalimentaire.dynamicforum.net
Admin
Admin


Nombre de messages : 37
Date d'inscription : 21/09/2006

MessageSujet: Re: L   Jeu 25 Oct - 8:01

LAIT ÉCRÉMÉ CYSTÉINÉ



Le chlorhydrate de cystéine abaisse le potentiel d’oxydo-réduction du milieu et permet la croissance des Clostridium.


FORMULE

Lait écrémé: 1000 ml
Chlorhydrate de cystéine: 0.8 g
pH = 7,2


Répartir en tube à raison de 10 ml par tube.
Autoclaver 30 minutes à 115°C.

UTILISATION ET LECTURE

Ensemencer largement après régénération
Etuver à 30°C ou 37°C pendant 5 à 7 jours.
On note l’absence ou la présence d’une coagulation, l’aspect du caillot puis son éventuelle digestion.



LAIT GELOSE



La gélose au lait est recommandé pour le dénombrement des microorganismes dans le lait avec la technique par comptage des colonies à 30°C (NF V 04-016) ainsi que dans la norme NF V 04-015 appliquée au lait de conserve pour le dénombrement des microorganismes revivifiables.

FORMULE

Peptone pancréatique de caséine: 5
Extrait de levure: 2.5
Glucose anhydre: 1
Lait écrémé en poudre exempt de substances inhibitrices: 1
Agar: 15,0
pH = 7,0


Dissoudre dans l’eau et porter à ébullition.
Répartir le milieu en tubes ou en flacons.
Stériliser à l’autoclave 15 minutes à°121°C.

UTILISATION ET LECTURE

Après préparation de la suspension mère et de ses dilutions ( au 1/10 pour les laits en poudre ; 1/3 pour les laits concentrés sucrés), prendre deux boîtes de Petri dans chacune desquelles est transféré 1 ml de la suspension mère avec une pipette stérile.
Prendre deux autres boîtes de Petri et tranférer, à l’aide d’une nouvelle pipette stérile 1 ml de la dilution au 1/10.. opérer de manière identique avec les dilutions suivantes.
Dans le cas de laitsstérilisé et stérilisé UHT, utiliser un ensemencement de 0,1 ml par boîte de Petri.
Couler dans chaque boîte de Pétri environ 15 ml du milieu au lait préalablement fondu et maintenu à 45°C dans un bain d’eau.
Le temps qui s’écoule entre la fin de la préparation de la suspension mère et le moment où toutes les dilutions sont en contact evec le milieu ne doit pas excéder 15 minutes.
Mélanger soigneusement l’inoculum et laisser se solidifier sur une surface plate et fraîche.

Après solidification et si l’on soupçonne le produit contenir des bactéries envahissantes, couler à la surface de la gélose 4 ml de gélose blanche préalablement liquéfiée.0
Laisser solidifier comme ci-dessus.

Retourner les boîtes et incuber à l’étuve à 30°C pendant 72 H.

Après la période d’incubation, procéder au comptage de toutes les colonies quelle que soit leur taille.
Ne retenir pour le dénombrement que les boîtes ne contenant pas plus de 300 colonies.


EXPRESSION DES RESULTATS

- Calculer la moyenne arithmétique du nombre de colonies comptées dans les deux boîtes d’une même dilution contenant entre 30 et 300 colonies, ou l’une contenant entre 30 et 300 colonies et l’autre moins de 30 colonies dans la même dilution.

Si l’une des boîtes contient entre 30 et 300 colonies et l’autre plus de 300 colonies, ne retenir que la première.
Prendre alors les deux chiffres significatifs en l’arrondissant:
• au plus proche multiple de 5, si le nombre est inférieur à 100
• au plus proche multiple de 20, si le nombre est supérieur à 100 et se termine par un 5
• au plus proche multiple de 10, si le nombre est supérieur à 100 et ne se termine pas par un 5.

Multiplier cette valeur par l’inverse du taux de dilution correspondant. On obtient alors le nombre de microorganismes par gramme de lait en conserve ou par millilitre de lait
- s’il existe des boîtes contenant entre 30 et 300 colonies au niveau de deux dilutions successives, calculer le nombre de microorganismes comme précédemment et prendre comme moyenne arithmétique les deux valeurs ainsi obtenues sauf si le rapport de la valeur la plus forte à la valeur la plus faible est supérieur à 2, dans ce cas ne retenir que la valeur la plus faible.

- Les deux boîtes au niveau de la suspension mère ou de l’échantillon pour essai, contiennent moins de 30 colonies, il y a :
• moins de 300 microorganismes par gramme de lait en poudre.
• moins de 90 microorganismes par gramme de lait concentré sucré.
• moins de 30 microorganismes dans la prise d’essai pour les autres laits.

- il n’existe aucune colonie au niveau de la suspension mère ou de l’échantillon pour essai il y a :
• moins de 10 microorganismes par gramme de lait en poudre.
• moins de 3 microorganismes par gramme de lait concentré sucré.
• moins de 1microorganisme dans la prise d’essai pour les autres laits.


LAIT TOURNESOLE



Le lait tournesolé est utilisé pour différencier les microorganismes sur la base de la production d’acide, la coagulation ou la protéolyse de la caséine.

Il est particulièrement utile dans la différenciation des espèces de Clostridium. Il peut être utilisé également pour la conservation des bactéries lactiques.

Plusieurs modifications du lait peuvent être observées; elles sont dues à l’action d’enzymes diverses et à leurs interférences :

- Enzymes glucidolytiques attaquant le lactose et provoquant acidification et coagulation;

- Enzymes protéolytiques hydrolysant la caséine; cette attaque pourra se traduire par une alcalinisation, une prise en masse ou la digestion des caillots quel qu’en soit le processus de formation;

- Réductases entraînant la décoloration de l’indicateur de pH.


FORMULE
.
Lait écrémé: 1000 ml
Teinture de tournesol à 40% QSP obtenir une teinte violacée: 15 à 20 ml
pH = 7,2

Répartir en tubes à raison de 10 ml par tube.
Stériliser 20 minutes à 110°C.


UTILISATION ET LECTURE

Ensemencer largement.
Etuver à 30 ou 37°C pendant 5 à 8 jours.

L’interprétation est empirique.
Acidification avec, souvent coagulation : attaque du lactose.

Alcalinisation simple : utilisation de la caséine.

Alcalinisation et peptonisation (éclaircissement progressif du milieu) attaque plus complète de la caséine, peptonisation après coagulation.

Réduction de l’indicateur débutant au fond du tube.



L. B. Miller
(LURIA BERTANI Bouillon)


Le bouillon LB Miller est utilisé pour la culture et la conservation d’Escherichia coli en biologie moléculaire.

C’est un milieu riche utilisé pour la croissance de cultures pures de recombinants. Escherichia coli est conduit jusqu’à la phase stationnaire dans le bouillon LB. Quelques vecteurs plasmidiques sont répliqués en grand nombre sans amplification sélective.

Le chloramphénicol ajouté au milieu inhibe la synthèse de la cellule hôte et prévient ainsi la réplication du chromosome bactérien.

Le bouillon LB Muller contient 20 fois plus de chlorure de sodium que la base LB et deux fois la teneur en ce même sel que le LB Lennox. Ceci permet de sélectionner les concentrations optimales salines pour des espèces spécifiques.

Les peptides et les peptones sont fournies par la tryptone. Les vitamines (dont la Vitamine B) et certains oligo éléments sont apportés par l’extrait de levure.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Extrait de levure: 5
Tryptone: 10
Sodium chlorure: 10
pH = 7,0


Mélanger les ingrédients et répartir le milieu en flacons de capacité appropriée.
Stériliser à l’autoclave à 121°c pendant 15 minutes.
Conserver le milieu reconstitué à 2-8°C.
Revenir en haut Aller en bas
Voir le profil de l'utilisateur http://microbioalimentaire.dynamicforum.net
 
L
Voir le sujet précédent Voir le sujet suivant Revenir en haut 
Page 1 sur 1

Permission de ce forum:Vous ne pouvez pas répondre aux sujets dans ce forum
MILIEUX DE CULTURE MICROBIO ALIMENTAIRE :: L-
Sauter vers: