MILIEUX DE CULTURE MICROBIO ALIMENTAIRE

manuel de milieux de culture
 
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Date d'inscription : 21/09/2006

MessageSujet: J   Lun 22 Oct - 9:23

JUS DE TOMATE


Ce milieu est préconisé comme milieu de base pour les cas généraux dans la recherche des Bacillus thermophiles dans les conserves

Les Bacillus thermophiles sont des micro-organismes sporulés, GRAM positif en culture jeune, se développant en aérobiose à 55°C, catalase positive (bien que certaines souches donnent une catalase faible ou tardive), lorsque l’essai est exécuté selon la norme.
Il fait l’objet d’une recommandation dans les normes AFNOR NF V 08-404.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Peptone : 10
Jus de tomate : 20 ml
Digestat pancréatique de lait (lait peptonisé) 10
pH= 6.1


Dissoudre les composants et ajuster le pH.
Dans le cas de l’étude de produits à pH<4,5, le pH peut être ajusté, après stérilisation, avec de l’acide lactique ou citrique.
Répartir le milieu de culture par quantités de 10 ml dans des tubes.
Stériliser à 121°C pendant 15 min.

UTILISATION

a) Recherche des formes asporulées
Ensemencer à raison de 3 tubes par milieu de culture. Le rapport inoculum/volume du milieu doit être de 1/10.
Pour les produits hétérogènes, la composition de l’inoculum doit être représentative de la conserve examinée

b) Recherche des formes sporulées

- cas des conserves de pH supérieur ou=4,5
Procéder comme précédemment puis plonger pendant 10 minutes, les tubes de milieux de culture ensemencés, dans un bain d’eau bouillante.
Il convient de veiller à ce que le niveau du bain soit supérieur au niveau du milieu de culture dans les tubes.
Retirer ensuite les tubes et les refroidir immédiatement dans un courant d’eau froide.
Cette technique a été choisie en raison de sa commodité et de son efficacité : toute croissance bactérienne ultérieure est due à la présence de spores thermorésistantes dans l’inoculum.

- cas des conserves de pH<4,5
Procéder à un chauffage, dans les mêmes conditions que ci-dessus mais à une température de 80°C maintenue pendant 10 minutes.

c) Incubation des milieux de culture
Placer les tubes de milieux de culture dans une étuve à 55°C pendant 5 jours.

LECTURE

Observer chaque jour les tubes, afin de déceler l’apparition de développement bactérien.
Repérer et sortir de l’étuve les tubes présentant un trouble et dès l’observation de ce dernier, réaliser un examen microscopique, après coloration de GRAM, afin de mettre en évidence des bacilles à GRAM positif en culture jeune et la présence éventuelle de spores.

- LECTURE PRELIMINAIRE
• CAS 1 : Aucun développement de bacilles à GRAM positif n’est mis en évidence dans les milieux de culture ensemencés : pas d’essai de confirmation à effectuer.
Absence de Bacillus thermophile

• CAS 2 : Aucun développement de bacilles à GRAM positif n’est mis en évidence dans les tubes ensemencés pour la recherche des formes végétatives, mais un développement à GRAM positif est mis en évidence dans les tubes ensemencés pour la recherche des formes sporulées : effectuer à partir de ces derniers les tests de confirmation ( essai de culture en aérobiose et recherche de la catalase).

• CAS 3 : Un développement de bacilles à GRAM positif est mis en évidence dans les tubes ensemencés pour la recherche des formes végétatives, mais aucun développement à GRAM positif n’est mis en évidence dans les tubes ensemencés pour la recherche des formes sporulées :effectuer à partir des tubes positifs tous les essais de confirmation ( mise en évidence des spores, essai de culture en aérobiose et recherche de la catalase).

• CAS 4 : Un développement de bacilles à GRAM positif est mis en évidence dans les tubes ensemencés ( recherches des formes végétatives et des formes sporulées) : effectuer à partir des tubes positifs sur la recherche des formes végétatives tous les essais de confirmation, et à partir des tubes positifs sur la recherche des formes sporulées les essais de confirmation ( essai de culture en aérobiose et recherche de la catalase).

- CONFIRMATION
• Mise en évidence des spores
A partir de chaque tube de milieux de culture ensemencés pour la recherche des formes végétatives présentant un développement microbien, ensemencer un tube du même milieu.
Pour les conserves de pH sup ou =4,5, plonger pendant 10 minutes les tubes ensemencés dans un bain d’eau à ébullition.
Pour les conserves à pH<4,5, plonger pendant 10 minutes les tubes ensemencés dans un bain d’eau à 80°C.
Incuber à 55°C pendant 5 jours puis procéder à la lecture comme décrit précédemment.
L’apparition d’une culture traduit l’aptitude à la sporulation des formes bacillaires observées dans les milieux de culture ensemencés pour la recherche des formes végétatives.

• Essai de culture en aérobiose et recherche de la catalase
a) A partir des milieux de culture ensemencés (formes végétatives et/ou sporulées) présentant un développement microbien, ensemencer en stries deux boîtes de Petri de milieu de culture gélosé ( de préférence milieu au jus de tomate) l’une après l’autre en se servant de la même anse.

Incuber à 55°C pendant 18 à 24 heures
Observer la présence ou l’absence de colonies. Les souches de Bacillus thermophiles ont parfois des difficultés de croissance, ce qui peut rendre l’observation des colonies difficile.

b) Lorsqu’il y a présence de colonies, les repérer selon leur type morphologique, émulsionner une colonie isolée, pour chaque type, dans un tube à hémolyse contenant 1 ml d’eau stérile ; y ajouter 2 à 3 gouttes du réactif pour la recherche de la catalase. La formation de bulle de gaz indique la présence d’une catalase.

• Résultats des essais de confirmation
CAS 2 :
- Une culture en aérobiose est obtenue, la recherche de la catalase est positive, conclure :
Présence de Bacillus thermophiles

- Une culture en aérobiose est obtenue, la recherche de la catalase est négative, conclure :
Présence de Bacillus thermophiles à catalase négative

- Aucune culture n’est obtenue en aérobiose, conclure :
Absence de Bacillus thermophile

CAS 3 :
- Un développement de bacilles à Gram Positif est mis en évidence, une culture en aérobiose est obtenue, la recherche de la catalase est positive, conclure
Présence de Bacillus thermophiles

- Un développement de bacilles à GRAM positif est mis en évidence, une culture en aérobiose est obtenue, la recherche de la catalase est négative, conclure :
Présence de Bacillus thermophiles à catalase négative

Pour les conserves à pH<4,5, plonger pendant 10 minutes les tubes ensemencés dans un bain d’eau à 80°C.
Incuber à 55°C pendant 5 jours puis procéder à la lecture comme décrit précédemment.
L’apparition d’une culture traduit l’aptitude à la sporulation des formes bacillaires observées dans les milieux de culture ensemencés pour la recherche des formes végétatives.

• Essai de culture en aérobiose et recherche de la catalase
a) A partir des milieux de culture ensemencés (formes végétatives et/ou sporulées) présentant un développement microbien, ensemencer en stries deux boîtes de Petri de milieu de culture gélosé ( de préférence milieu au jus de tomate) l’une après l’autre en se servant de la même anse.

Incuber à 55°C pendant 18 à 24 heures
Observer la présence ou l’absence de colonies. Les souches de Bacillus thermophiles ont parfois des difficultés de croissance, ce qui peut rendre l’observation des colonies difficile.

b) Lorsqu’il y a présence de colonies, les repérer selon leur type morphologique, émulsionner une colonie isolée, pour chaque type, dans un tube à hémolyse contenant 1 ml d’eau stérile ; y ajouter 2 à 3 gouttes du réactif pour la recherche de la catalase. La formation de bulle de gaz indique la présence d’une catalase.

• Résultats des essais de confirmation
CAS 2 :
- Une culture en aérobiose est obtenue, la recherche de la catalase est positive, conclure :
Présence de Bacillus thermophiles

- Une culture en aérobiose est obtenue, la recherche de la catalase est négative, conclure :
Présence de Bacillus thermophiles à catalase négative

- Aucune culture n’est obtenue en aérobiose, conclure :
Absence de Bacillus thermophile

CAS 3 :
- Un développement de bacilles à Gram Positif est mis en évidence, une culture en aérobiose est obtenue, la recherche de la catalase est positive, conclure
Présence de Bacillus thermophiles

- Un développement de bacilles à GRAM positif est mis en évidence, une culture en aérobiose est obtenue, la recherche de la catalase est négative, conclure :
Présence de Bacillus thermophiles à catalase négative

- Un développement de bacilles à GRAM positif est mis en évidence, mais aucune culture en aérobiose n’est obtenue, conclure :
Absence de Bacillus thermophile

- Aucun développement de bacilles à GRAM positif n’est mis en évidence et aucune culture n’est obtenue en aérobiose, conclure :
Absence de Bacillus thermophile

- Aucun développement de bacilles à GRAM positif n’est mis en évidence, mais une culture en aérobiose est obtenue et la recherche de la catalase est négative ou positive, conclure :
Présence de Bacillus thermophiles dont l’aptitude à la sporulation n’a pas été démontrée

CAS 4
- A partir des tubes de recherche des formes sporulées, une culture en aérobiose est obtenue, la recherche de la catalase est positive, conclure :
Présence de Bacillus thermophiles

- A partir des tubes de recherche des formes sporulées, une culture en aérobiose est obtenue, la recherche de la catalase est négative. Utiliser alors les résultats obtenus à partir des essais effectués avec les tubes positifs de la recherche des formes végétatives lorsque la recherche de la culture en aérobiose est positive et si le test de la catalase est positif, conclure :
Présence de Bacillus thermophiles
Si le test de la catalase est négative, conclure :
Présence de Bacillus thermophiles catalase négative

- A partir des tubes positifs (recherche des formes sporulées), aucune culture n’est obtenue en aérobiose. Utiliser alors les résultats des essais effectués à partir des tubes pour la recherche des formes végétatives. Lire et interpréter les résultats comme ci-dessus (cas 3).
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